Die Rolle der IFN-gamma Signalübertragung und von MyD88 in der Angiotensin-II-induzierten vaskulären Dysfunkion, Inflammation und arteriellen Hypertonie

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von myelomonozytären Zellen, IFN-gamma (Interferon gamma), MyD88 (myeloid differentiation factor 88) und zugrundeliegenden Signalwege in der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Inflammation, Dysfunktion und arteriellen Hypertonie untersucht. Wie bereits veröffentlichte Vordaten aus meiner Arbeitsgruppe zeigten, schützt die Depletion von Lysozym M (LysM)+ myelomonozytären Zellen (Diphteriatoxin-vermittelt in Mäusen, die transgen für den humanen Diphtheriatoxin-Rezeptor sind, LysMiDTR Mäuse) vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und arterieller Hypertonie, und kann durch adoptiven Zelltransfer von Wildtyp Monozyten wiederhergestellt werden. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Rekonstitution von Monozyten-depletierten LysMiDTR Mäusen mit Wildtyp Monozyten den Phänotyp der vaskulären Dysfunktion wiederherstellen kann, die Rekonstitution mit gp91phox-/y oder Agtr1-/- Monozyten jedoch nicht. Die Hypertonus-mediierenden Effekte dieser infiltrierenden Monozyten scheinen demnach von der intakten ATII und NADPH Oxidase Signalübertragung in diesen Zellen abhängig zu sein. Vermutlich ebenfalls für die Aktivierung der Monozyten funktionell wichtig sind IFN-gamma, produziert durch NK-Zellen, und der Transkriptionsfaktor T-bet (T-box expressed in T cells), exprimiert von NK-Zellen und Monozyten. IFN-gamma-/- Mäuse waren partiell geschützt vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und charakterisiert durch reduzierte Level an Superoxid im Gefäß im Vergleich zu ATII-infundierten Wildtyp Mäusen. IFN-gamma-/- und T-bet defiziente Tbx21-/- Mäuse zeichneten sich ferner durch eine reduzierte ATII-mediierte Rekrutierung von NK1.1+ NK-Zellen, als ein Hautproduzent von IFN-gamma, sowie CD11b+GR-1low Interleukin-12 (IL-12) kompetenten Monozyten aus. Durch Depletions- und adoptive Transferexperimente konnte ich in dieser Arbeit NK-Zellen als essentielle Mitstreiter in der vaskulären Dysfunktion identifizieren und stellte fest, dass T-bet+LysM+ myelomonozytäre Zellen für die NK-Zellrekrutierung in die Gefäßwand und lokale IFN-gamma Produktion benötigt werden. Damit wurde erstmals NK-Zellen eine essentielle Rolle in der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion zugeschrieben. Außerdem wurde der T-bet-IFN-gamma Signalweg und die gegenseitige Monozyten-NK-Zellaktivierung als ein potentielles therapeutisches Ziel in kardiovaskulären Erkrankungen aufgedeckt. Des Weiteren identifizierte ich in meiner Arbeit MyD88 als ein zentrales Signalmolekül in der ATII-getriebenen Inflammation und vaskulären Gefäßschädigung. MyD88 Defizienz reduzierte den ATII-induzierten Anstieg des systolischen Blutdrucks und die endotheliale und glattmuskuläre vaskuläre Dysfunktion. Zusätzlich waren die vaskuläre Superoxid-Bildung sowie die Expressionslevel der NADPH Oxidase, der wichtigsten Quelle für oxidativem Stress im Gefäß, in ATII-infundierten MyD88-/- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen deckte ich zudem auf, dass die ATII-induzierte Einwanderung von CD45+ Leukozyten, insbesondere CD11b+Ly6G-Ly6Chigh inflammatorischen Monozyten in MyD88-/- Mäusen signifikant abgeschwächt war. Diese Resultate wurden durch immunhistochemische Untersuchung von Aortengewebe auf CD68+, F4/80+ und Nox2+ Makrophagen/Phagozyten sowie Expressionsanalysen von Inflammationsmarkern untermauert. Analysen der mRNA Expression in Aortengewebe zeigten ferner eine in Wildtyp Mäusen nach ATII Infusion tendenziell gesteigerte Expression von inflammatorischen Monozytenmakern sowie eine abnehmende Expression von reparativen Monozytenmarken, während dieser Shift zu einem proinflammatorsichen Phänotyp in MyD88-/- blockiert zu sein schien. Dies zeigt eine Rolle von MyD88 in der terminalen Differenzierung von myelomonozytären Zellen an. Um dies weitergehend zu untersuchen und aufzudecken, ob die MyD88 Effekte abhängig sind von Zellen der hämatopoetischen Linie oder Gewebszellen, wurden Knochenmarktransferexperimente durchgeführt. MyD88 Defizienz in Knochenmark-abstammende Zellen reduzierte die ATII-induzierte vaskuläre Dysfunktion und Infiltration der Gefäßwand mit CD45+ Leukozyten und inflammatorischen myelomonozytären Zellen. Die protektiven Effekte der MyD88 Defizienz in der Angiotensin II-induzierten Inflammation konnten nicht auf Signalwege über die Toll-like Rezeptoren TLR2, -7 oder -9 zurückgeführt werden, wie die Untersuchung der vaskulären Reaktivität entsprechender Knockout Mäuse zeigte. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit zeigen, dass die Infiltration der Gefäßwand mit Nox2+AT1R+T-bet+MyD88+ myelomonozytären Zellen und die Wechselwirkung und gegenseitige Aktivierung dieser Zellen mit IFN-gamma produzierenden NK-Zellen eine zentrale Bedeutung in der Pathogenese der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Dysfunktion, Inflammation und arteriellen Hypertonie einnehmen.

Transkriptionelle Regulation des humanen Interferon-gamma-Promotors in T-Lymphocyten

Interferon-gamma is mainly produced by activated T helper cells and cytotoxic T lymphocytes and sustains the immune-defense against viral and bacterial infections. For a better understanding of IFN-gamma promoter regulation in T cells, different DNA-binding motivs were examined. Hereby, a new motiv (-196 to -183) was identified, that binds to the transcription factor AP-1 in T helper cells and Jurkat T cells. This factor acts as an essential activator protein. Further investigation demonstrated that IL-12 and IL-18 induce different regulatory pathways. Both AP-1 and STAT-4 bindings at their cognate DNA elements (-196 to -183 and -224 to -215) are required for the IL-12 dependent activation whereas IL-18 causes direct activation via AP-1.Moreover, the TH2 cytokine IL-4 represses significantly the IFN-gamma promoter activity in CD4+ T cells. IL-4 induces GATA-3, that interacts with two DNA-motivs (-111 to -87) at the IFN-gamma promoter.Furthermore, transgenic mice were generated, yielding a human IFN-gamma promoter construct (410 bp) under the control of a luciferase reporter gene. The data demonstrated a specific IFN-gamma promoter activation by antiCD3 plus antiCD28 in CD4+ and CD8+ T cells. The luciferase activty in CD4+ T cells was reinforced by addition of IL-12 and IL-18 and repressed by IL-4.

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann.